Em 1682, a Venerável Ordem Terceira de São Francisco do Porto fundou um recolhimento para doze irmãs entrevadas, instalado num quintal que a Ordem possuía junto à capela. As fundadoras foram nove irmãs, cinco viúvas e quatro casadas, que custearam a sua instalação e foram eleitas e nomeadas no dia de Santa Isabel, Rainha de Portugal, a 4 de julho. Eram elas: D. Mariana da Costa, viúva do comendador e irmão Manuel Gomes; D. Isabel de Albuquerque, viúva de António Pinto, fidalgo da Casa Real; Doroteia de Jesus, viúva do irmão e benfeitor Pedro Blens; Luísa Marques, viúva do irmão Bento da Costa; Isabel Soares, viúva do irmão João Pinheiro; Inês, mulher do irmão Gregório Bezerra de Aguiar; Maria de Mesquita, mulher do irmão Domingos Mendes; Paula Pinto, mulher do irmão António da Mota; e Berta de Abreu, mulher do irmão Manuel de Sousa Meireles. A obra iniciou-se em 11 de agosto e terminou em 19 de novembro de 1686, com um custo de 250 000 réis.
Em 13 de março de 1711, o recolhimento foi substituído por um hospital "de enfermos" e, entre 1734 e 1743, este deu lugar a um hospital destinado a todos os doentes da Ordem, curáveis e crónicos, intitulado Hospital de Santa Isabel.
Em janeiro de 1746, um incêndio destruiu o edifício e chegou a atingir a Capela da Ordem. Decidiu-se, então, construir um cemitério e, por cima dele, uma Casa de Despacho e Secretaria, obra confiada a Nicolau Nasoni.
Segundo o Regimento de 1750, o hospital era governado por dois mordomos eleitos mensalmente, um deles era um antigo mesário e atuava como tesoureiro. O pessoal incluía ainda padres capelães, enfermeiros e enfermeiras, uma cozinheira e um porteiro.
Ao longo dos séculos XVIII e XIX, seguiram-se outras fases construtivas, conhecidas graças à abundante documentação preservada até hoje, como o inventário do hospital de 1788, publicado por Natália e Jaime Ferreira-Alves. No século XIX, assinala-se ainda a generosidade de dois beneméritos do Brasil, que financiaram novas etapas das obras: o irmão Joaquim António Ferreira (1777-1859), barão de Guaratiba, e Francisco José da Rocha Leão (1781-1853), primeiro barão de Itamarati.
A partir do século XIX, à medida que a instituição evolui funcionalmente, surgem novos tipos documentais, como tabelas de despesas com géneros alimentícios, registos de internamentos e mapas diários do hospital. Em 1852, na sessão da Mesa de 9 de junho, foi aprovado um regulamento interno do hospital, compilado por uma comissão eleita pela Mesa, que ouviu alguns irmãos que exerciam o cargo de mordomos do hospital. O regulamento era composto por disposições gerais e por catorze capítulos.
No século XX, o regulamento interno de 1902 do hospital-asilo estabelecia como atribuições tratar os doentes, recolher os entrevados, asilar os inválidos, internar particulares e distribuir diariamente sopa e pão aos pobres. Seguiu-se uma nova fase com a Comissão Instaladora dos Serviços do Hospital (1913-1914), que deixou um livro de atas, e, a partir de 1946, existem registos da Caixa Sindical de Previdência do Pessoal da Indústria Têxtil – Registo de Operações (1946-1950). Atualmente, o hospital dispõe de inúmeras valências e acompanha as mais recentes inovações tecnológicas em diversas áreas de tratamento.